PG电子专注于提供细胞体外基因敲除解决方案，特别是针对细胞基因敲除的定制服务。目前，我们已开发了多种细分的敲除服务。欢迎随时咨询PG电子团队，获取相关技术路线及成功案例资料。

PG电子提供真核细胞体外基因敲除的定制服务，并将定期更新常见问题解答（Q&A），以便更好地服务我们的客户。以下是最新版本的Q&A，涵盖了前1-20个关于基因敲除定制服务的相关问题，供您详细了解：

服务指南

请参考PG电子的高通量基因敲除定制服务（RNP法）手册。

常见问题解答

21. 如何验证基因敲除是否成功？

验证基因敲除成功与否通常需要通过PCR、测序或Western blot等实验手段进行确认。

22. 精准敲除和模糊敲除如何区别？

（1）精准敲除：通过同源重组（HDR，Homology-Directed Repair）机制，在目标基因中引入精确的修饰（如特定片段删除、点突变或插入），从而完全或部分失活基因功能。此方法的实验策略与一般基因敲除有所不同。
（2）模糊敲除：通过非同源末端连接（NHEJ，Non-Homologous End Joining）机制，在目标基因的指定区域中随机引入插入或缺失（Indel）突变，从而破坏基因功能。

23. CRISPR/Cas9方法可以敲除的最大片段范围大概有多少？

理论上，CRISPR/Cas9可以实现1kb至1Mb范围的基因敲除。结合多靶点切割技术或其他技术（如CRISPRa/i、表观遗传修饰），可实现超大型片段的敲除（可达1Mb）。

24. 如何提高原代细胞的编辑效率？

可以通过以下方法提高编辑效率：

• 使用病毒载体，如慢病毒和AAV整合至基因组。
• 电场诱导细胞膜穿孔，适用于贴壁或悬浮的原代细胞（需优化参数）。
• 核转染，直接将Cas9-RNP导入细胞核，适合难转染细胞（如原代T细胞）。
• 使用脂质纳米颗粒包裹Cas9-sgRNA复合物，以支持原代肝细胞或成纤维细胞的转染效果。

25. 如何提高基因敲除效率？

优化设计sgRNA的序列及选择合适的传递工具可显著提高效率。

26. 如何分析基因敲除后的表型变化？

通过细胞增殖、死亡率、功能性实验等多方面来观察和记录表型变化。

27. 如何区分纯合敲除与杂合敲除？

纯合敲除意味着两个基因拷贝均被敲除，而杂合敲除则是只有一个拷贝被敲除。

28. CRISPR RNP法的适用细胞及场景有哪些？

该方法适用于多种细胞类型，包括但不限于原代细胞和细胞系，具体取决于实验的设计及需求。

结语

CRISPR/Cas9 RNP基因编辑法将目标基因对应的多条体外合成的single-guide RNA（sgRNA）与Cas9蛋白混合成核糖核蛋白复合物（RNP），通过电转化或脂质体转染的方式将RNP递送到细胞内，这种方法效率高且遗传稳定，不再依赖传统的慢病毒或质粒法。

由于RNP可在72小时内完成基因组编辑后即被降解，不会引入外源序列，因此能够最大限度地保持细胞的原有表型，减少脱靶效应，是目前可行性最高的选择。此法有助于避免病毒基因组的随机整合以及传统方法中Cas9和sgRNA的持续表达造成的基因组不稳定性及高脱靶风险。PG电子正致力于推动CRISPR/Cas9 RNP法的应用，全面替代传统的基因敲除方式。