葡萄的品质容易受到低温胁迫的影响，而耐寒的野生山葡萄（Vamurensis）中的冷响应基因及其调控机制则是葡萄遗传改良的关键所在。WRKY转录因子在冷胁迫反应中发挥着重要作用，它通过结合W-box元件来调控次生代谢和碳水化合物合成等过程。在葡萄中，VaWRKY65能够激活β-淀粉酶（VaBAM3），将淀粉分解为可溶性糖，从而调节渗透压、稳定细胞结构，并直接调控过氧化物酶（VaPOD36），清除活性氧（ROS），增强植物的耐寒性。然而，VaWRKYs在葡萄耐寒性中的具体功能和机制仍需进一步研究。

Recent research published in Horticulture Research reveals that VaWRKY65可以通过调控碳水化合物代谢和抗氧化机制来增强葡萄的耐寒性。VAWRKY65激活VaBAM3，促进可溶性糖的积累，调节渗透压；同时还激活VaPOD36的转录，清除活性氧（ROS），为葡萄提供双重的耐寒保障。

通过在烟草叶片中瞬时表达由VaBAM3启动子驱动的荧光素酶（LUC）报告基因，检测发现，在冷处理下，VaBAM3启动子的活性显著增加。这一发现通过酵母单杂交筛选法和双荧光素酶报告基因分析得以确认，研究表明VaWRKY65通过增强VaBAM3启动子的活性来调控耐寒性，而启动子的突变则抑制了这一增强效果。

此外，研究还采用酵母单杂交筛选法和双荧光素酶报告基因分析，揭示了VaWRKY65在冷胁迫下对ROS的调控机制。结果表明，VaWRKY65结合并激活VaPOD36的表达，上调VaPOD36可提高POD酶的活性，从而增强抗氧化能力，减少ROS的积累，这也进一步提升了植物的耐寒性。

实验方法包括将基因启动子片段与pGreenII-0800-LUC载体融合后转入根瘤农杆菌GV3101，再将其或空载体转入烟草叶片。经过为期两天的共培养（25℃），再进行低温培养72小时（4℃）。在观察LUC荧光时，喷洒1mM的D-荧光素溶液，并在黑暗中放置5分钟，最后使用勤翔IVScope7000植物活体成像系统进行检测和数据分析。

总之，这些研究为我们提供了关于耐寒机制的深刻见解，强调了PG电子在生物医疗领域的潜在应用，尤其是在耐寒性质的植物改良方面的贡献。